Clonación. 

La clonación consiste en la creación de una copia genéticamente idéntica o réplica; en biología se refiere a la recreación de un organismo completo a partir de otro; esto se conoce como clonación reproductiva. Mucho antes de que se pudiera clonar un organismo entero, los investigadores empezaron duplicando pequeños fragmentos de ADN, técnica conocida como clonación molecular.

La clonación de ADN permite crear una copia de cualquier parte específica de una secuencia de ADN (o ARN) que se selecciona entre muchas otras y producirla en gran cantidad.

Clonación molecular.

Para reproducir un fragmento de ADN, éste se tiene que insertar en una célula bacteriana, de tal forma que por medio de esta célula dicho fragmento se copie o exprese; para hacerlo, el fragmento de ADN, que se quiere clonar, tiene que insertarse en un plásmido (también llamado vector), que es una molécula pequeña de ADN circular que se replica de forma independiente del ADN cromosómico de la bacteria. Generalmente se utilizan plásmidos modificados para este propósito; así cuando la bacteria comienza su división, replica tanto su ADN como los plásmidos que posee, incluido el plásmido con el fragmento de interés. En una célula bacteriana se puede insertar prácticamente cualquier fragmento de ADN (al que se le llama ADN exógeno) del genoma humano o de algún otro organismo de interés.

Clonación reproductiva.

La clonación reproductiva se utiliza para hacer una copia idéntica de un organismo multicelular completo. Debido a que la mayoría de los organismos se reproducen de forma sexual, es imposible crear organismos idénticos a cualquiera de sus progenitores. Esto se debe a que la reproducción sexual involucra la contribución de ADN de dos individuos diferentes, los padres.

Para producir un individuo por clonación artificial es necesario: tomar el óvulo de un individuo; remover el núcleo haploide; posteriormente, extraer el núcleo diploide de alguna célula somática de un segundo individuo (donador), y transferirlo al óvulo al cual se le extirpó el núcleo haploide; una vez hecho esto se estimula la división celular.

Técnicas de clonación de organismos.

   Transferencia nuclear de células somáticas

   Esta técnica consiste en la transferencia del núcleo de una célula somática a un ovocito. Una célula somática es cualquier célula del cuerpo que no sea una célula germinal (esperma u ovulo). Un ejemplo de una célula somática sería una célula de la sangre, células del corazón, células de la piel, etc.

     En este proceso, el núcleo de una célula somática se retira y se inserta en un óvulo fertilizado cuyo núcleo ha sido eliminado. El ovocito con su núcleo donado a continuación, se nutre y se divide hasta que se convierte en un embrión. El embrión se implanta y se desarrolla dentro de la madre receptora.

Conceptualmente, la transferencia nuclear consta de tres fases:

    Enucleación del óvulo: Primero debe eliminarse el material genético del ovocito receptor. Puede realizarse mediante micro manipulación o por métodos químicos.

    Transferencia del núcleo: generalmente se realiza mediante fusión del cariosoma (núcleo celular envuelto por una pequeña porción de citoplasma) con el citoplasma del ovocito, por electrofusión o con algún fusogénico (virus Sendai). Como alternativa se puede realizar por microinyección, como si se tratase de un procedimiento de inyección intracitoplásmatica de esperma.

    Activación del ovocito: puesto que, a diferencia del espermatozoide, las células embrionarias o adultas no son capaces de activar el ovocito, debe inducirse la activación una vez realizada la transferencia del núcleo para que el ovocito reprograme el genoma introducido y empiece el programa de desarrollo embrionario o algún estímulo químico (etanol o estroncio), o bien combinando ambos.

Técnica de Roslin

La técnica de Roslin es una variación de la transferencia nuclear de células somáticas que fue desarrollado por investigadores del Instituto Roslin. Los investigadores utilizaron este método para crear a Dolly.

     En este proceso, se permite a las células somáticas (con núcleos intactos) crecer y dividirse, es entonces cuando el medio nutritivo en pases sucesivos va disminuyendo su concentración de proteínas nutritivas, desde un 10% hasta el 0,5%. De este modo, se consigue detener la división de las células en cultivo e inducirlas a un estado de quiescencia (reposo). Se toman óvulos y se les extrae el núcleo, posteriormente se ponen en contacto las células quiescentes cultivadas con los óvulos enucleados, y se les somete a un breve pulso eléctrico.

Las células se fusionan y el óvulo  se desarrolla en un embrión que se implanta en una madre sustituta.

Técnica Honolulu

En este método el núcleo de la célula somática es extraído e implantado en un óvulo sin núcleo. Luego es bañado en una solución química y cultivado. El embrión es entonces implantado en la madre y se desarrolla hasta el nacimiento.

Esta técnica de transferencia nuclear utiliza la microinyección para generar células  diploides. La activación invitro del óvulo tiene lugar mediante su incubación en un medio sin calcio que contiene estroncio y citocalasina B para prevenir la formación del cuerpo polar.

En bacterias:

Transformación natural.

Es una adaptación natural de las bacterias para la transferencia de ADN que depende de la expresión de numerosos genes de bacterias cuyos productos parecen ser responsables de este proceso. El ADN integrado en el cromosoma huésped es generalmente (pero con raras excepciones) derivada de otra bacteria de la misma especie, y por lo tanto es homóloga al cromosoma residente.

La competencia para la transformación es inducida típicamente por una alta densidad de células y / o limitación nutricional, afecciones asociadas con la fase estacionaria de crecimiento bacteriano.

Transformación, como una adaptación para la reparación del ADN.

En este tipo de transformación la competencia es inducida específicamente por condiciones perjudiciales para el ADN. Por ejemplo, la transformación se induce en Streptococcus pneumoniae por los agentes que dañan el ADN mitomicina C (un agente de reticulación de ADN) y las fluoroquinolonas (un inhibidor de la topoisomerasa que causa roturas en la doble cadena). En B. subtilis, la transformación se incrementa por la luz UV , un agente que daña el ADN.

TRANSFORMACIÓN BACTERIANA.

Implica la introducción de ADN exógeno (que no pertenece a la bacteria) a la bacteria mediante un vector, las bacterias a veces pueden contener círculos más pequeños de ADN, llamados plásmidos(vectores), que tienen un número mucho más pequeño de genes. Los plásmidos se pueden intercambiar entre las bacterias en un proceso llamado conjugación, este ADN pasa a ser parte del material genético en la bacteria, pudiendo ser heredado por las nuevas células todas las veces en las que la bacteria se multiplique, es decir  a través de la manipulación genética se puede crear un carácter presente en la bacteria que pasará a ser hereditario.

Una vez dentro de la célula, el plásmido se copia por la propia maquinaria de replicación del ADN de la célula huésped.

En el laboratorio, los plásmidos están diseñados específicamente para que el ADN que contienen se copiará por bacterias.

                                            

Para permitir la entrada de ADN del plasmido en las células bacterianas, estas bacterias deben presentar condiciones fisiológicas especiales. Este estado fisiológico especial es llamado competencia.

Quimiocompetentes
Electrocompetentes

Una bacteria competente es aquella que está apta para recibir ADN exógeno. Las bacterias competentes son bastante frágiles y debe ser manipuladas con cuidado.

Antes de la transformación, las bacterias se tratan con una sustancia química llamada cloruro de calcio, lo que hace que el agua entre en las células y hace que se hinchen. Estas bacterias que están hinchadas son conocidas como bacterias competentes.

A continuación, el ADN del plásmido (que contiene el ADN extraño) se mezcla con las bacterias competentes y la solución se calienta. El ADN plásmido introduce la bacteria a través de pequeños poros creados en las membranas celulares. Una vez en la célula huésped, el ADN plásmido se copia muchas veces por la propia maquinaria de replicación del ADN de las bacterias.

Después de la transformación, las bacterias se cultivan en un alimento rico en nutriente llamado agar. Sólo las bacterias que contienen un plásmido con resistencia a los antibióticos crecerán en presencia de antibióticos.

Por ejemplo, si las bacterias se cultivan en agar que contiene un antibiótico, sólo las bacterias que han sido transformadas con un plásmido que contiene el gen de resistencia para el antibiótico sobrevivirán.

Las bacterias transformadas se pueden cultivar en grandes cantidades. El ADN de interés, o la proteína codificada por el ADN, a continuación, pueden ser aislados y purificados.

Example Protocol: Standard heat-shock transformation of chemically competent bacteria

·         Take competent cells out of -80°C and thaw on ice (approximately 20-30min).

·         Take agar plates (containing the appropriate antibiotic) out of 4°C to warm up to room temperature or place in 37°C incubator.

·         Mix 1 to 5μl of DNA (usually 10pg to 100ng) into 20-50μL of competent cells in a microcentrifuge or falcon tube. GENTLY mix by flicking the bottom of the tube with your finger a few times.

·         Note: Transformation efficiencies will be approximately 10-fold lower for ligation of inserts to vectors than for an intact control plasmid.

·         Place the competent cell/DNA mixture on ice for 20-30min.

·         Heat shock each transformation tube by placing the bottom 1/2 to 2/3 of the tube into a 42°C water bath for 30-60 seconds (45sec is usually ideal, but this varies depending on the competent cells you are using).

·         Put the tubes back on ice for 2 min.

·         Add 250-500μl LB or SOC media (without antibiotic) and grow in 37°C shaking incubator for 45min.

Note: This outgrowth step allows the bacteria time to generate the antibiotic resistance proteins encoded on the plasmid backbone so that they will be able to grow once plated on the antibiotic containing agar plate. This step is not critical for Ampicillin resistance but is much more important for other antibiotic resistances.

·         Plate some or all of the transformation onto a 10cm LB agar plate containing the appropriate antibiotic.

Note: We recommend that you plate 50μL on one plate and the rest on a second plate. This gives the best chance of getting single colonies, while allowing you to recover all transformants.

·         Incubate plates at 37°C overnight.

¿Cuando se utiliza la transformación?

La transformación bacteriana se utiliza:

·         Para realizar varias copias del ADN, llamada clonación de ADN.

·         Para hacer grandes cantidades de proteínas específicas humanos, por ejemplo, la insulina humana, que pueden ser utilizados para tratar a las personas con diabetes de tipo I.

·         Para modificar genéticamente una bacteria u otra célula.

Aplicaciones de la transformación.

En el área agrícola se emplea para incrementar la productividad de los cultivos, especialmente mediante la reducción de los costos de producción logrados disminuyendo la necesidad de plaguicidas, sobre todo en las zonas templadas. La aplicación de la biotecnología puede mejorar la calidad de vida, creando cepas de mayor rendimiento, o que pueden crecer en ambientes diversos, lograr una rotación mejor para conservar los recursos naturales o plantas más nutritivas, que se conservan mejor cuando están almacenadas o están siendo transportadas. Se consigue así un abastecimiento continuo de alimentos a bajo costo.

Las características más frecuentes de las nuevas variedades son la resistencia a insectos (algodón, maíz), resistencia a los herbicidas (soya) y maduración lenta de la fruta (tomate).

En animales Cuando se quiere expresar proteínas farmacológicas para abastecer grandes demandas, se debe pensar en producir la s en grandes cantidades. Pero, a su vez, la producción de estas proteínas dentro del animal no debe interferir con la biología misma del organismo. Por ello se pensó en obtener las nuevas moléculas a partir de la leche de los animales de granja. Las ventajas de esta estrategia consisten en que es un método natural con muy bajo impacto ambiental (no se utilizan plantas industriales para la producción de la proteína), y el costo de producción es relativamente bajo. Además, la leche es un fluido corporal renovable secretado por los mamíferos en cantidades sustanciales, que permite una purificación relativamente simple de la proteína de interés.

Las posibles estrategias para producir y usar animales transgénicos resistentes a la mastitis se fundamentan en la variedad de sustancias antimicrobianas presentes en la glándula mamaria de los bovinos.

Cuando una bacteria logra atravesar el canal del pezón las probabilidades de mastitis son altas. Pero los animales muestran diferentes grados de susceptibilidad para enfermarse y en buena parte esa resistencia es determinada genéticamente.

Referencias:

GeneReviews® 

Pagon RA, Adam MP, Ardinger HH, et al., editors.

Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2016.

WormBook: The Online Review of C. elegans Biology

Pasadena (CA): WormBook; 2005-.

http://smcg.ccg.unam.mx/actividades/divulgacion/1erTDCG_eldnavaalaescuela/doctos/3ra_sesion_TDCG.pdf